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固相合成手艺因其操作轻盈、易于实现自动化，已成为合成小核酸和多肽药物的常用要领之一。近年来，微波辅助合成和流动合成手艺的引入进一步提升了固相合成的合效果率和产量。然而，这些手艺通常依赖腾贵且高度专业化的仪器，限制了其在通例实验室中的普及。别的，现在在Fmoc固相合成中普遍使用的活化试剂HATU，保存热稳固性差和清静隐患。
鉴于此，瑞士日内瓦大学Nicolas Winssinger团队使用通用的液相剖析系统，通过将其刷新用于流动化学手艺，实现高效液相色谱仪（HPLC）到多肽合成仪的转变。
HPLC是常用的疏散剖析手艺，样品经色谱柱疏散组分，实现样品的纯度检测。该团队立异的在色谱柱前的�；ぶ刑畛�10mg树脂作为微型流动反应器，内置2 μm熔块，以避免树脂流失，同时借助DAD检测器（检测Fmoc脱�；じ辈罚┦凳狈聪旌闲Ч�。
该计划接纳TBEC（1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺）/Oxyma（2-肟氰乙酸乙酯）作为活化系统，无需特殊加碱和预活化办法，不但简化了流程，还越发的清静和环保。
在上述装备和活化系统基础上，为探索合成条件，以苯丙氨酸五聚体为模子，在刷新的HPLC系统上举行优化条件。实验效果批注，经优化后的条件可乐成合成目的五肽，且实现粗品纯度＞93%单步纯度＞99%。
详细要领如下：
整个合成流程包括如下几个阶段：
1. 称重及负载树脂：称取10 mg树脂（如Rink Amide树脂）填入空�；ぶ�，密封牢靠；
2. 树脂溶胀：将负载树脂的�；ぶ攵燃淄橹�，溶胀3-5分钟；
3. 装置：设置柱温箱温度为80℃，并将�；ぶ爸弥炼杂χЪ苤�；
4. 试剂溶液配备：
样品溶液：设置0.6 M Fmoc氨基酸、TBEC和Oxyma的NMP溶液，并等体积混淆获得0.2M溶液；
脱�；と芤海涸贒MF中加入20%体积的哌啶，转入自动进样器小瓶中备用；
5. 编写注射序列程序：设置仪器交替注射，活化的氨基酸衍生物溶液（用于偶联）和20%哌啶的DMF溶液（用于脱�；ぃ�；另外，在合成最先前，需一连举行两次脱�；�，以确保初始Fmoc基团完全去除。
6. 树脂裂解和脱�；ぃ航；ぶ攵燃淄橹腥コＳ郉MF；然后取出树脂，浸没在TFA溶液中（TFA/三异丙基硅烷TIS/H2O=95:2.5:2.5），反应3小时，以抵达完全解离和脱�；�。关于含半胱氨酸，甲硫氨酸等的特殊序列，可使用TFA/1,2-乙二硫醇EDT / TIS / H2O=90 : 5 : 2.5 : 2.5混淆裂解液。
7. 产品处置惩罚：疏散树脂，使多肽粗品析出，进一步纯化。
关于组氨酸等易消旋的氨基酸及部分特殊氨基酸而言，预活化时间对其偶联效率具有显著影响：该团队在合成20肽时，较量了新制活性酯和预活化24小时后打的偶联效率，发明Fmoc-Arg(pbf)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH在长时间活化后偶联效率较量低。
为进一步研究预活化时间对偶联效率的影响，以Fmoc-Arg(pbf)-OH为质料划分在预活化15分钟和24小时后合成FRF三肽。效果显示，预活化24小时后，偶联效率显著降低，归其缘故原由是Fmoc-Arg(pbf)-OH在活化后，会履历分子内环化，降低其反应性。经重复试验验证，理想的活化溶液应在制备4小时内使用。
肽合成历程中的异构化可能会影响立体化学纯度并改变生物活性。为评估在该合成条件下的消旋化水平，该团队接纳液相合成要领，对脯氨酸、半胱氨酸和丝氨酸等易消旋的氨基酸举行考察，均未发明消旋化征象。进一步较量TBEC/Oxyma系统和HATU/DIPEA系统的偶联效果，团队接纳新鲜活化的His(Trt)举行反应，实验发明前者差向异构化为3.6%，此后者异构化比例为4.8%。
该团队乐成合成了GLP-1（30氨基酸）和比伐卢定（20氨基酸）等多肽，其中使用含10 mg树脂的合成柱合成GLP-1的收率为52.1%。而在生物活性方面，用HPLC合成的比伐卢定粗品和通过通例SPPS合成的比伐卢定纯品具有相似的生物活性（见下图）。
现成的HPLC应用于自动化流体合成多肽，具有以下优势和缺乏之处：
1. 优势：
将标准HPLC转变为多功效合成平台；
接纳更清静的TBEC/Oxyma活化系统；
可获得高纯度多肽，同时能够实时监控反应；
立体选择性好，可合成重大序列多肽；
经济性好，接纳普遍可用的HPLC装备，降低装备本钱，可惠及更多实验室；
无邪性高，可用于多肽/寡核苷酸的合成，还可以通过替换柱子在合成和纯化模式之间切换。
2. 局限性：
对某些重大序列无法合成；
差别的氨基酸或肽链之间的反应速率保存差别，需进一步优化；
合成量较小，仅适用于微克至毫克级的合成。
该研究提供了一种简朴、清静且经济的多肽合成平台，使用通例HPLC系统，实现了反应和检测的同步举行。此计划不但坚持了产品的立体化学完整性，还可以合成具有生物活性的重大序列片断，有助于推动流动合成手艺在更多实验室中的普及。
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参考文献：
[1] Romanens, P.; Barluenga, M. D.; Winssinger, N., et al. Peptides on Tap: Automated Flow Synthesis with Standard HPLC [J]. ChemRxiv. 2025.
